脊髓性肌萎缩（suō）症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一（yī）种常（cháng）染色（sè）体隐性遗传病，居儿童致死（sǐ）性常染色体隐性遗传病（bìng）的第2位（wèi）。位（wèi）于染色体5q11.2～q13.3上的运动神经元存活基因（yīn）（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主（zhǔ）要致病基因。

　　人基因（yīn）组有两（liǎng）个紧邻的（de）高度同源的SMN基因：端粒侧的SMN1和着丝粒（lì）侧的SMN2，两者仅有（yǒu）5个碱基不同。SMN1是主（zhǔ）要功能基（jī）因，该基（jī）因（yīn）突变可导致（zhì）SMA发病，SMN2为临床（chuáng）表型的调节基（jī）因（yīn），影响病情的（de）严重程度（dù），其拷贝数增加可减轻SMA表型（xíng）。目（mù）前已知约94％的SMA患（huàn）者为SMN1基因第7和（或）第8外显子纯合缺失（shī）所致，少（shǎo）数（shù）病例可由SMN1基因点突变或小的缺失引（yǐn）起。

　　SMN1基因外显（xiǎn）子（zǐ）缺失检测的意义

　　SMA在人群中的发病率为1/5000～1/10000，群体携带者频率为1/35～1/50，是出生缺陷的高危因素，因此（cǐ）极（jí）有（yǒu）必要进行SMA携（xié）带者的人（rén）群（qún）筛查，并通过（guò）产前诊（zhěn）断技术降低（dī）人（rén）群中（zhōng）SMA患儿的出生率。

　　临床上将SMA分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即婴儿型、中间型（xíng）和少年型（xíng），严重程度依次递减。神经专科医生一般根据患者发病年（nián）龄、临（lín）床表现及病情进展（zhǎn）程度进行临床（chuáng）诊断（duàn），辅助检（jiǎn）查方法包括（kuò）肌电图、肌酶（méi）和肌肉（ròu）活（huó）检，结合家族（zú）史和（hé）SMN1基因分析可进行（háng）确诊。由于（yú）SMA患（huàn）儿中约（yuē）94%为SMN1基因外显子纯合缺失，因（yīn）此，SMN1基因缺失检测对于SMA的诊断（duàn）具（jù）有（yǒu）更高的（de）灵敏度和特异性。且对不同型（xíng）的SMA患者，SMN1纯合缺失率没有显著差异，所以（yǐ），SMN1纯合缺失的检（jiǎn）测对（duì）于不同型SMA患者具有相同的临（lín）床诊断（duàn）价值。在欧（ōu）美人群中，SMN1基因纯合缺失检测已成（chéng）为诊断和排除诊断SMA的首选方法。

　　SMN1基因缺失检测试剂（jì）的现状

　　目（mù）前，SMN1基因（yīn）外显子缺失检测试剂较为缺乏，临床检（jiǎn）验实验室较为公（gōng）认的（de）方法是PCR结（jié）合（hé）限制性片（piàn）段长度（dù）多（duō）态性（xìng）（PCR-RFLP）的方法。但该方法操（cāo）作较为繁琐，且（qiě）重复性（xìng）差，不利（lì）于（yú）标准化，不易推广。同（tóng）时，这（zhè）种方法（fǎ）只能检测出纯合缺失，无（wú）法确认杂合缺（quē）失。

　　荷（hé）兰的SMAMLPA检测试剂可（kě）对待（dài）测靶序列进行半定量分析，因此（cǐ）既可检测纯合缺失（shī），亦可确认杂合缺失。在国内（nèi）外已有多篇文（wén）献报（bào）道（dào）采用该方法进（jìn）行SMA患者诊断和SMA携带者筛查。但（dàn）该（gāi）产品目前仍为“仅用于研究”的（de）试剂，尚未按照体（tǐ）外诊断类医（yī）疗（liáo）器械上市（98/79/EC）。

　　2015年底，原国家食（shí）品药品监管总（zǒng）局批准了第一项SMN1缺失突（tū）变检（jiǎn）测试剂上市。该（gāi）产品采用多重实时荧光MGB-TaqMan探针PCR法，以人基因组单拷贝基因RPP40为内参（cān）基因，对SMN1基因（yīn）第7外显（xiǎn）子和第8外显（xiǎn）子拷贝数进行相对定量检测，用于SMA患者的（de）体外（wài）辅助（zhù）分子（zǐ）诊断。SMN1基因外显子缺失检（jiǎn）测的难（nán）点（diǎn）之一在于排除高同源（yuán）性基因SMN2的干扰，特（tè）别是对（duì）于SMN2高拷贝数的受试（shì）者（zhě），需保证结果的准确可靠。该产品通（tōng）过对实时荧（yíng）光PCR相（xiàng）对定量、绝对定量技术进行系统整合，并在反应（yīng）体系中加入特定化学组分，以抑制PCR引物3’端的胞嘧啶（C）与胸（xiōng）腺嘧啶（T）的错配，增加（jiā）PCR扩增的特异性（xìng），从而有效控制SMN2基因（yīn）非特异（yì）性（xìng）扩增对检测结果的影响（xiǎng），准确检出高（gāo）拷贝数SMN2样本中SMN1基因第7和第8外显子的缺失（shī）情况。

　　鉴于国内外尚无任何按照体外诊断（duàn）试剂批准上市的（de）SMA分子诊断产品（pǐn），因此临床（chuáng）试验（yàn）方案（àn）中依据EMQN关于《SMA分子诊断最佳实践指南》，采用了国内（nèi）外SMA体外辅助（zhù）分（fèn）子诊断领域公认的PCR-RFLP法作为对照方法。临床试验共完成1069例，其中正常对照组777例，SMA病（bìng）例组292例（lì），统（tǒng）计分析（xī）结果显（xiǎn）示申报产品与对比方（fāng）法检测结果的一致性（xìng）为100%（95%置信区（qū）间：99.66%～100%）。此外（wài），9747例正常成年人大样本中目标外显子（zǐ）△△Ct分布（bù）范围的调查亦显（xiǎn）示（shì），该产品（pǐn）的纯合突变判断界值设置合理。

　　该试剂目前批准的预期用途仅包（bāo）含（hán）纯合缺失的检测，尚不能（néng）用（yòng）于杂合缺失（shī）的（de）检测（cè），因此无法（fǎ）用于SMA携带（dài）者的筛查，这是该产品的缺陷之一（yī）。

　　事（shì）实上，该产品（pǐn）在设计上已（yǐ）考（kǎo）虑到（dào）SMA携带者的检测，其检测原（yuán）理是以待测样本中目标外显子荧光（guāng）信号Ct值与（yǔ）内参基因荧光信号（hào）Ct值之差（△Ct_s），与正常对（duì）照（zhào）品三个梯（tī）度稀（xī）释品中目标外（wài）显（xiǎn）子荧光（guāng）信号（hào）Ct值和内参（cān）基因荧光信号Ct值之差的平均值（zhí）（△Ct_a）之（zhī）差，即△△Ct，作为（wéi）待（dài）测样本中目（mù）标外（wài）显（xiǎn）子拷贝（bèi）数检测变量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根据实时荧光（guāng）定量PCR相（xiàng）对定（dìng）量的基本数学原理推导得到申（shēn）报产（chǎn）品检测变量（liàng）△△Ct的计（jì）算公式，依据这一计算公式可（kě）推导出纯合（hé）缺失、杂合缺失（shī）和野（yě）生型的（de）△△Ct理论值（或范围）；再（zài）结合目标外显子与内参基因扩（kuò）增效（xiào）率差（chà）异以及SMN2不同拷贝数的影响，可对上（shàng）述（shù）△△Ct理论（lùn）值进行优化。结果显示纯（chún）合缺（quē）失、杂（zá）合缺失（shī）和野生型的△△Ct值（或范（fàn）围）之间可设置合理（lǐ）的判断界（jiè）值，因此理论上该产品可（kě）分（fèn）别检测出三种基因状态。但（dàn）鉴（jiàn）于（yú）生产企业对杂合（hé）缺失与野生型之（zhī）间的判断界值研究尚不透彻，再加上缺乏可（kě）判定杂（zá）合缺失的（de）对比（bǐ）方法等其他困难，本（běn）次注册申请的预（yù）期用途仅限于（yú）检测纯合突变（biàn），即SMA患者辅助诊断。

　　综上，SMN1基因（yīn）外显子缺失检测在SMA疾病诊（zhěn）断和（hé）SMA携带者筛查中（zhōng）具有重（chóng）要的临床价值。然而（ér）到目前为止，受到技术（shù）水平的限制，相关的（de）体外诊断试剂比较缺乏，特别是可用（yòng）于SMA携带者（zhě）筛（shāi）查的杂合缺（quē）失检测，尚无适合的体外诊断（duàn）试剂上市。（器审中（zhōng）心审评（píng）六部（bù）  何静云）

来源：中国医药（yào）报